科普：CRISPR 基因编辑技术的应用、争议和未来

编者按：什么是CRISPR？ 科学界为什么对于其潜在的应用如此着迷？这种技术和古老的细菌防御系统有什么联系？它又将如何影响我们周围的世界？本文编译自CBInsights上原标题为What Is CRISPR?的文章。

想象一下未来，父母可以定制宝宝的样子，选择未出世孩子的身高和眼睛颜色。所有特质都可以根据个人喜好定制：家养宠物的大小，植物的寿命等。

这听起来像是反乌托邦科幻小说，但其实这并不是遥不可及。

2012年，科学家们首次发现CRISPR，并对CRISPR（也称为Cas9或CRISPR-Cas9）的应用感到惊讶。

CRISPR可能会彻底改变我们应对一些问题的方法，如癌症，食物短缺和器官移植。 在最近的报告中，CRISPR甚至可以被用作诊断疾病的工具。 但是，与任何新技术一样，它也可能会导致意想不到的问题。

不断变化的DNA - 生命的代码 - 将不可避免地导致一系列难以预想的后果。 社会和各行业如果不了解CRISPR的基础知识，就无法应用这项技术。

接下来，让我们从其定义，应用和局限性深入了解CRISPR。

什么是CRISPR？

CRISPR是细菌遗传密码及其免疫系统的一个定义性特征，是细菌用来保护自己免受病毒攻击的防御系统。它也存在于古生物界（单细胞微生物）中的生物体中。

首字母缩写词“CRISPR”代表 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats。实质上，它是一系列重复的DNA序列，并且这些DNA之间存在“spacers”。

简而言之，细菌利用这些基因序列来“记住”攻击它们的每种病毒。

细菌会将病毒的DNA整合到自己的细菌基因组中。这种病毒DNA最终成为CRISPR序列中的“spacers ”。这种防御系统可以在同种病毒再次发起攻击时给予细菌保护或免疫力。

总是位于CRISPR附近的基因，称为Cas（CRISPR相关）基因。

一旦激活，这些基因就会产生特殊的蛋白质，这些蛋白质是与CRISPR共同进化的酶。这些Cas酶能够充当切割DNA的“分子剪刀”。

回顾一下：实际上，当病毒侵入细菌时，其独特的DNA会被整合到细菌基因组中的CRISPR序列中。这意味着下一次病毒攻击时，细菌会记住它并发送RNA和Cas来定位和破坏病毒。

虽然细菌中还有其他Cas酶在病毒攻击自己时会截断病毒，但Cas9是动物体内执行这种任务的最佳酶。大众所熟知的术语CRISPR-Cas9是指切割动物（和人类）DNA的Cas酶的种类。

为了更好的应用这项技术，研究人员增加了一个新的步骤：在CRISPR-Cas9切割DNA后，携带“固定”基因的新DNA序列可以嵌入到新的间隔中。或者，切割可以同时“敲除”不需要的基因，例如，导致疾病的基因。

换个更加形象的说法，CRISPR-Cas9类似于Word中的“查找和替换”功能：CRISPR-Cas9想要查找并更正遗传数据（或“单词”），用新材料替换它。或者，正如CRISPR的先驱Jennifer Doudna在其A Crack In Creation: Gene Editing and the Unthinkable Power to Control Evolution一书中所提到的那样，CRISPR就像一把瑞士军刀，我们的使用方式不同，它发挥的功能也不同。

CRISPR研究的飞速发展，已经超越了基础DNA编辑。 2017年12月，Salk研究所设计了CRISPR-Cas9系统的不成熟版本，能够在没有编辑基因组的情况下激活或关闭目标基因。展望未来，这种技术可以解决基因编辑永久性的问题。

CRISPR如何工作？

下面是帮助CRISPR-Cas9完成其工作的三大关键因素：

1.向导RNA：定位目标基因的一段RNA（DNA的遗传表亲）。这是在实验室中设计的。

2.CRISPR相关蛋白9（Cas9）：将不需要的DNA剪掉的“剪刀”

3.DNA：切段后插入的所需DNA片段

下面将介绍它们是如何工作的。

向导RNA可作为“GPS坐标”，用于在目标基因片段上查找想要编辑的DNA片段。 一旦定位成功，Cas9剪刀就会在DNA中产生双链断裂，然后插入所需的DNA片段取而代之。

这项技术的确会威胁到医疗。 但除此之外，它还可以改变我们吃的食物到我们用作燃料的化学品，因为这些也可以通过基因技术设计。

来自麻省理工学院和哈佛大学研究所的张锋博士用童谣描述了CRISPR：

Twinkle Twinkle Big Star → Twinkle Twinkle Little Star

在这个过程中：

1.向导RNA定位错误或突变：单词“Big”。

2.Cas9酶切断“Big”一词。

3.插入正确的DNA片段，即单词“Little”。

CRISPR的应用

每个行业都可以利用CRISPR：它可以为人类疾病创造新的药物，帮助农民种植抗病作物，创造新的动植物物种，甚至让灭绝的物种起死回生。

动物研究

自最初发现CRISPR以来，其应用的领域迅速扩大。虽然还处于早期阶段，但“动物模型”（即实验室动物）已经向我们展示了如何操纵CRISPR技术。

小鼠是研究CRISPR治疗潜力的实验对象。拥有超过人类90%的基因，小鼠是哺乳动物中理想的实验对象。

小鼠实验表明，CRISPR可以消除与假肥大性肌营养不良（DMD）相关的缺陷基因，抑制神经性舞蹈病蛋白质的形成并消除HIV感染。

2015年，中国科学家通过去肌肉生长抑制素基因基因创造了两个超级肌肉小猎犬。在没有该基因的情况下，小猎犬表现出“肌肉肥大”，明显比未经基因改造的犬更强壮。

其他CRISPR动物试验包括将长绒山羊用于高产羊绒和繁殖无角奶牛。

人类研究

与动物研究相比，编辑人类DNA的CRISPR实验发展较缓慢，主要是由于伦理和监管问题。

鉴于改变人类基因组的永久性，FDA对于CRISPR的态度是谨慎的。 一些科学家甚至提出应该暂停CRISPR试验，直到我们获得更多有关该技术对人类潜在影响的信息。

美国和欧洲

2018年，美国和欧洲进行了CRISPR人体试验。

目前（截至2018年2月13日），宾夕法尼亚大学正在等待FDA对于一项研究的最终批准。 该研究旨在评估应用CRISPR治疗多发性骨髓瘤，黑色素瘤和肉瘤患者的安全性。

欧洲也可能会在2018年首次进行人体CRISPR研究。CRISPR Therapeutics的研究集中在一种称为β-地中海贫血的血液疾病上，这种疾病会导致血红蛋白的成分改变。

虽然涉及患者参与的临床试验仍在等待监管机构的批准，但CRISPR已经应用于活体和非活体人类胚胎实验中。

例如，2017年8月，由俄勒冈州健康和科学大学的生殖生物学家Shoukhrat Mitalipov领导的一个小组获得了私人赞助，使用CRISPR-Cas9识别了导致心肌增厚的胚胎突变。突变的胚胎在实验室将突变率恢复到了72％（高于普通50％的遗传率）。

一些批评人士说，胚胎的基因编辑是不道德的，即使编辑过的胚胎不用于移植。目前这种类型的测试无法获得联邦资助，都是依靠私人赞助。

中国

在世界的另一边，监管框架也完全不同。 一些医院伦理委员会可以在一天内批准研究，不需要征求联邦机构的批准。

自2015年以来，中国一直在进行CRISPR人体试验以对抗各种癌症，艾滋病毒和HPV。 中国是迄今为止唯一进行人体试验的国家。

据ClinicalTrials.Gov报道，中国有10项正在进行或即将开展的针对晚期癌症的CRISPR治疗试验，如4期胃癌和鼻咽癌。 到目前为止，据说一些患者的肿瘤缩小了，但没有官方消息。

虽然我们对这项技术的长期副作用尚未完全了解，但CRISPR已成为中国一些已用尽所有常规治疗方案的患者的最后选择。

涉及的行业

CRISPR将会影响的行业包括医药，食品，农业和工业生物技术。 由于CRISPR-Cas9基因编辑系统非常容易建立和使用，各个领域的研究人员都可以利用这项技术。

制药和生物技术

未来的医学将用CRISPR编写。

目前的药物的研发需要花很长时间，因为需要确保药物的安全性，还需彻底了解药物的副作用。 而且，目前的美国监管政策往往导致研发进程长达数十年。

然而，应用CRISPR的团队可以将定制疗法更快地推向市场，加速了传统的药物研发过程。

Timeline of drug development. Credit: PhRMA

CRISPR更加便宜和灵活，它能快速地识别潜在的目标基因，进行高效的临床前实验。因为它可以用来“敲除”不同的基因，CRISPR为研究人员提供了一种更快，更实惠地研究成千上万个基因的方式，方便查看哪些基因受特定疾病的影响。

当然，随着药物研发过程更加简便，CRISPR提供了治疗患者的新方法。

例如，单基因疾病 - 由单一基因突变引起的疾病 – 可以进行CRISPR试验。这些疾病的性质为治疗提供了确切的目标：单个基因的突变。

基于血液的单基因疾病如β-地中海贫血或镰状细胞也是CRISPR治疗的理想对象，因为这些疾病能够在体外进行治疗（称为离体治疗）。患者的血细胞可以被取出，用CRISPR技术治疗，然后放回到体内。

粮食和农业

早在二十世纪二十年代，酸奶公司 Danisco 就开创了CRISPR的早期应用，当时科学家们使用早期版本的CRISPR来对抗牛奶和酸奶中的主要细菌（嗜热链球菌），该细菌总是被病毒感染。 那时候，CRISPR技术仍不成熟。

由于气候变化的影响，我们急需使用CRISPR保护粮食和农产品免受新细菌的侵害。 例如，随着种植区域变得越来越热和干燥，可可的种植变得越来越难。 这种环境变化将进一步加剧病原体造成的损害。

为了解决这个问题，加州大学伯克利分校的创新基因组学研究所（IGI）正在应用CRISPR来制造抗病可可。领先的巧克力供应商MARS Inc.也在支持这项研究。

基因编辑可以使种植更加高效。它可以缓解马铃薯和西红柿等主要作物的全球粮食短缺，也可以创造出不受干旱和其他环境影响的作物。

监管机构对基因编辑作物几乎没有任何抵触情绪，美国农业部（USDA）也没有管理这一领域。这主要是因为当CRISPR应用于农作物时，不会带来任何外源DNA：CRISPR仅用于编辑作物自身的遗传信息，选择理想的性状。

2016年，被改造成耐褐变的白色蘑菇成为第一个通过美国农业部批准的CRISPR编辑的有机体。 2017年10月，农业公司DuPont Pioneer和Broad研究所将互相合作，利用其CRISPR-Cas9知识产权进行农业研究。

今年1月，生物技术公司Yield10 Bioscience获得CRISPR植物亚麻籽油（假亚麻）的批准，该亚麻籽油增强了ω-3油，用于制造植物油和动物饲料。

这些迹象表明，新品种的农作物比以前想象的更快地进入市场。 如果没有美国农业部的监督，这些产品和其他食品可能会较快地投入生产。

这会影响我们吃的食物，因为食物被编辑以后，有可能以携带更多的营养物质或可以在杂货架上保存更长时间。

另一个领域是生产更精瘦的家畜。

2017年10月，北京中国科学院的科学家使用CRISPR对猪肉进行遗传工程改造，使猪体脂肪减少了24％。

研究人员将小鼠基因插入猪细胞中，这样猪可以更好地调节体温。

将这种技术应用于人类食物将是一个值得关注的领域。

工业生物技术

另一个不太明显的领域是工业生物技术。 使用CRISPR重新设计微生物，研究人员可以创建新材料。

这与整个社会有什么关系？

从工业角度来看，这对改造和创造新的化学产品来说非常重要。 我们可以改变微生物以增加多样性，创造新的生物材料，并制造更高效的生物燃料。 从香水中的活性化学物质到工业洗洁精中的活性化学物质，CRISPR会对创造新的更高效的生物材料产生巨大影响。

Jennifer Doudna的第一个CRISPR创业公司Caribou Biosciences成立于2011年，为各行各业提供非治疗性研究，是为各种行业提供CRISPR技术的主要公司之一。

局限性

CRISPR的潜在利益非常多，但是这项技术也有局限性。

非预期的效应和所有未知变量都是这项新技术的缺点，而新的道德问题和争议也在近期因为人体试验而出现。

副作用

使用CRISPR进行人体治疗时，安全性是最大的问题。与任何新技术一样，研究人员不确定CRISPR的整个影响范围。

Off-target activity是主要问题。单个基因编辑可能导致基因组中其他地方发生意外。这可能导致组织异常生长，导致癌症。我们需要更精确，更精确的基因识别。

另一个问题是马赛克生成的可能性。在CRISPR治疗后，患者可以混合编辑和未编辑的细胞，即“马赛克”。随着细胞不断分裂和复制，一些细胞可能会被修复，而其他细胞则不会被修复。

最后，免疫系统并发症意味着这些干预和治疗可能会引发患者免疫系统的不良反应。早期的研究表明，免疫系统可以在达到目的之前处理Cas酶，或者会导致不良反应，例如炎症等。 （1999年，美国的一位患者死于严重的免疫反应，CRISPR试验中研究人员应该更加的谨慎。）

但是，这三个限制都有解决方案。

不同的酶（“分子剪刀”）或更精确的运载工具可以减少Off-target activity。如果对卵子或精子中的修饰干细胞（即可以变成人体内每个细胞的细胞）进行编辑，也可以避免马赛克。

随着免疫系统发生问题，研究人员可以将不同的Cas蛋白与人类尚不免疫的更隐蔽的细菌株分离开来，以避免不必要的免疫反应。同时，也可以进行体外治疗，科学家将患者的血液细胞拿出到体外，并在把它们放回去之前对其进行治疗，也可以绕过免疫系统。

生物选择

CRISPR的一个潜在的重大限制是CRISPR-Cas9系统缺乏手术精确度。 Cas酶切割DNA双螺旋的两条链，这种“双链断裂”引起人们对切割精准度的担忧。

尽管目前Cas9酶是“切割”酶中最受关注的，但科学家们正在积极寻找其替代品。

其他选择包括较小版本的Cas9，或完全不同的酶：Cpf1，因为其容易运输到目标DNA位置而受欢迎。

除了使用其他Cas酶之外，用于治疗基因的运输载体是另一种替代工具。 无害病毒可将治疗基因携带到突变位点，而脂质纳米颗粒可避免免疫系统检测，避免免疫反应。 这两种选择都是极具潜力的研究途径。

争议

当技术可以改变生命法则时，其影响是深远的， 它的争议也是如此。下面将列出一些关于CRISPR的主要争议。

设计你自己的宝宝？

如果我们知道某个基因的位置在哪里，可以利用CRISPR以多种方式操纵它。

按照这种逻辑，宠物主人可以用特定的毛色和尺寸设计他们想要的狗。更重要的是，父母还可以修改控制身高或眼睛颜色的基因来“设计”自己的孩子。如果我们能够分离出与智力相关的基因，那孩子的智商也可以被操纵。

虽然批评人士说这种技术只能用于治疗需求，但CRISPR的快速发展似乎不会减慢，基因编辑技术的已经被用于非治疗目的手术中。

2015年，北京基因组研究所（BGI）通过去除与生长有关的基因，创造了“微型猪”。这种猪只有30磅，这与猪100磅的正常体重相差甚远。 BGI最初想要以约1,600美元每只的价格卖出这些微型猪，并且为消费者提供定制尺寸和颜色选择。但该计划最终于2017年停止。

尽管BGI使用TALENs而非CRISPR来编辑猪的基因，但CRISPR在设计未来宠物时也引发了类似的担忧。这种设计应用程序有可能导致动物和人类进化方向的永久性，导致不可逆转的转折点。

让灭绝动物复活

最后一只长毛的猛犸象出现在3600年前。如果我们能够让这些古代生物起死回生，我们应该这么做吗？目的是什么？无论是出于好奇还是为了有效的科学实验，这个领域都颇具争议。

简而言之，灭绝物种复活是为了让灭绝的动物起死回生。首先我们需要找到灭绝动物最近的活体亲属的胚胎，并使用CRISPR-Cas9在其基因中插入已灭绝物种的DNA，这样一只已灭绝的动物可以再次漫游这个星球。

不同的科学团体和组织已经在采取这些行动。值得注意的是，The Long Now基金会的一个名为“复兴与恢复”的项目旨在再造已经灭绝的动物，如旅鸽和猛犸象。Broad 研究所的遗传学家乔治教一直致力于实现这一项目。

Credit: Revive & Restore

猛犸象对许多科学家来说是非常具有吸引力的。编辑亚洲大象基因组并插入来自古老长毛茸猛犸象组织中的基因，这或许可以是长毛猛犸象复活，或者造出古代生物的杂交版本。

在这种情况下，我们也需要考虑气候因素：一些研究人员认为，猛犸象对远北森林的有很大影响，这可能会恢复永久冻土，并且减少排放到大气中的碳。

灭绝物种复活的倡导者们也表示，人类直接导致许多物种灭绝，因此，我们应该共同努力扭转这一趋势。

批评者担心，像这样操纵自然可能会带来更多的伤害而不是积极影响，可能会创造出威胁人类崛起或现在环境的物种。

遗传中的不可逆遗传变异

利用CRISPR进行“生殖细胞改造”引发科学界的担忧。

改造体细胞，如皮肤，大脑，肌肉和心脏细胞不会传递给后代。然而，生殖细胞改造修改的是卵子或精子细胞中的基因，因此这样的改造将遗传给后代。

生殖细胞改造引发了一个问题：从道德层面上，我们是否可以选择我们想要遗传给后代的基因？

生殖细胞改造的后果是为什么现在研究人员仅使用非活体的人类胚胎进行CRISPR研究的原因之一。2017年3月，中国第一次在六个活体胚胎上进行了CRISPR实验。值得注意的是，实验显示基因编辑的成功率比先前使用非活体胚胎的实验更高。

尽管围绕这个问题存在争议，但显然，改造生殖细胞的好处是可以阻止或防止疾病表现为个体发育。生殖细胞疗法也可以保证患者体内的每个细胞都接受治疗。

即使一个成年人天生就是易得癌症的体质，通过CRISPR编辑生殖细胞基因，他也可以痊愈，就像从没从未患过癌症一样。

生物黑客

生物黑客表示他们希望利用CRISPR将缩短之前长时间的研发过程，但这引发了人们的讨论：他们是否应该受到监管以及监管的办法。

Image: DIY Bacterial Gene Engineering CRISPR Kit, Credit: The Odin

最近由Do-It-Yourself (DIY)生物黑客发起的众筹活动引起了众多关注。 生物黑客初创公司Odin在其网站上销售DIY Bacterial CRISPR试剂盒，零售价为159美元。2017年10月，Odin的首席执行官Josiah Zayner在于旧金山举行的合成生物学会议上为自己注入了CRISPR改造肌肉生长的基因。

目前，这种生物检测仍然没有相关规定，因为它是自我注射，而不是对其他人的实验。 但是，FDA确实禁止了这种以治疗为目的自我注射试剂的销售。

CRISPR的未来

CRISPR技术的未来应用基本上与生命形式本身一样不可估量。虽然目前的研究主要针对治疗或食品技术，但CRISPR-Cas9技术还有一些不为人熟知但非常实际的应用。

异种移植

异种移植是将另一种动物的细胞，组织或器官移植到人类接受者体中的行为。

由于对器官移植的需求量很高，但供应量无法满足需求，因此异种移植可能为等待器官移植的病人带来希望。

该过程大概如下所示：

1.科学家在活猪内注射人类干细胞。

2.这些人类干细胞在该猪体内生长并分化成特定类型的细胞。

3.通过Cas9的“教导”，干细胞最终成长为某种类型的细胞（即心脏，肝脏，胰腺等）。

2017年1月，总部位于加利福尼亚的Salk研究所宣布自己已经制造出一种由猪和人类细胞组成的嵌合体生物体，在科学界引起了很大的轰动。

Xenotransplantation, Credit: eGenesis

科学家先前已经在鼠的干细胞中进行了异种移植：科学家先用CRISPR-Cas9去除在小鼠中产生胰腺的基因，然后将大鼠干细胞插入小鼠胚胎中。按照程序，小鼠将继续长出大鼠胰腺。

后来，研究人员在猪胚胎中插入了人体干细胞（称为诱导多能干细胞或iPSC）。出于安全性和有效性的考虑，该研究在4周后停止。研究人员确实注意到一些移植到这些猪胚胎的干细胞，正在变成人体组织。虽然该试验的成功率比起小鼠胚胎的实验低很多，但这仍然是一项科学成就。

由George Church共同创立的eGenesis，目前也在这一领域进行研究，目标是为人类在猪体内培育人类器官。 2017年8月，科学家对猪胚胎中的60多个基因进行了改造，目的是为了消除人体在移植时排斥的逆转录病毒。

如果研究人员能想出一种在活着的动物体内培养人类细胞的方法，那么他们可以创造出与患者百分百匹配的器官。每个患者的干细胞都可以生长出由自己独一无二的DNA构成的器官，从而减少排斥和器官衰竭等风险。

基因驱动可能会导致进化混乱

一个没有蚊子的未来也是一个没有疟疾的未来，寨卡病毒，基孔肯雅病毒，登革热 - 这个名词不断涌现。 没有这些昆虫传播疾病，世界各地的生命将不会受到这些疾病的威胁。

CRISPR可以帮助我们到达这个目的。 然而从进化的角度来讲，一个好主意可能会导致灾难性的后果。

一般来说，每个基因有50％的机会被遗传给后代。 但基因驱动却可以用来确保某种基因有更大的遗传几率。

如果科学家通过遗传编辑技术改变基因驱动，他们则可以为进化创造一个加速通道。

Credit: E. OTWELL AND M. TELFER, ScienceNews.org

2016年12月，伦敦帝国理工学院的研究人员设想了一种消除整个携带疟疾寄生虫蚊子种群的方法。 若想实现这个想法，可以通过使用CRISPR系统编辑基因并添加DNA序列，从而引起蚊子胚胎中的偏倚遗传。 随着这些蚊子发育并长成成虫，它们会与其他野生蚊子交配，这样整个蚊子种群会停止携带疟疾。

但在短期看来，这样一个好办法会破坏野生生态系统的自然平衡，改变自然进化的过程。通过生态系统造成的多米诺骨牌效应是无法预测的。

基因组编辑是一种大规模杀伤性武器？

2016年2月，由国家情报局局长詹姆斯克拉珀编写的《美国情报部门全球威胁评估报告》中提到，“基因组编辑”被列在潜在自然安全威胁下的“大规模毁灭和扩散性武器”。

EcoNexus和ETC Group等遗传监督组织警告大众说，基因编辑可能会被滥用。 CRISPR可以成为生物恐怖分子的灵感来源，他们能通过设计新病原体来创造新一代生物武器。如果一只昆虫能携带并传递毒素，这项技术可能会被犯罪组织利用。

美国国防部的高级研究计划局（DARPA）已经在为应对这些情况做准备，并正在开发解毒剂，他们也正在努力寻找能够扭转有害基因驱动效应的解决方案。

专利战争

自从关于CRISPR及其应用的第一篇论文于2012年出版以来，加州大学伯克利分校的科学家Jennifer Doudna和Broad Institute的张锋一直在竞争申请这项技术的专利权。

2017年2月，美国专利和商标局最终授予在美国专利商标局授予了张锋CRISPR-Cas9的专利权。然而，欧洲专利局（EPO）本月刚刚撤销了Broad的一项专利权。

展望未来，CRISPR相关的专利权战争及其对该领域研究的影响将值得关注。随着大量专利族的兴起，未来的CRISPR专利战将持续升温。

结束语

基因编辑的未来在100,50甚至10年后可能发生翻天覆地的变化。

未来，在植物，动物甚至人类中修改或设计基因可能会合法，这也将给基因库和进化过程造成不可逆转的影响。

虽然上面提出的一些想法在目前看来似乎很牵强，但这的确很有可能发生。毕竟，CRISPR不是一种昂贵和难以获得的技术。CRISPR技术现在可以使用，很多人也正在使用这项技术。从农民到研究人员，CRISPR将对我们的社会产生不可估量影响。